一(yi)次性使用的(de)組件為(wei)生(sheng)物制品的(de)生(sheng)產帶來(lai)了(le)很多優勢。它們干凈、買來(lai)即用、不需要滅菌，因(yin)此也就減少了(le)如沖洗用水系統(tong)（WFI）和蒸汽發(fa)生器檢修的(de)需(xu)求。一次性的(de)組(zu)件不能(neng)用(yong)于后續的(de)操作，消除(chu)了(le)工(gong)藝(yi)流程運行(xing)之(zhi)間(jian)交叉污染的(de)可能(neng)性。因(yin)(yin)為減少或擯棄了(le)對(dui)不銹(xiu)鋼設(she)備(bei)的(de)需(xu)求，也可以(yi)避(bi)免了(le)設(she)備(bei)組(zu)裝(zhuang)的(de)長周期。系(xi)統的(de)復雜度降低，因(yin)(yin)而所(suo)涉(she)及(ji)的(de)工(gong)程需(xu)求也同樣減少。再也無需(xu)在位清(qing)洗（CIP）或在位滅菌（SIP）操作，以及相關的管道、閥門、控制器或容器的壓力等級。此外，一次性組件的使用還降低了驗證的復雜度。因為幾乎沒有可反復使用的組件，也就沒有什么項目需要跟蹤，也就節省了大量的滅菌、清潔驗證研究。zui后，通過消除了堅固的管道系統和固定發酵罐的限制，一次性組件還有利于實現更快速的改裝以便用于新流程的運行。一次性組件的使用可在勞力、設備、廠房設計以及驗證方面實實在在地節省可觀的費用。一次性的組件包括：生物處理袋、管、囊式過濾器、切向流艙、生物反應器、層析艙及混合系統。
圖1. 波浪生物(wu)反應器(qi)。20/50EH 系統。
一次性(xing)生物反應(ying)器的(de)使用(yong)及放大
在某些應用(yong)中(zhong)(zhong)，灌(guan)流(liu)式(shi)(shi)細(xi)胞培養(yang)(yang)比分批和(he)補(bu)料(liao)分批工(gong)藝更具優(you)勢。操作方(fang)(fang)式(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)選擇是根據工(gong)藝規程(cheng)(cheng)所(suo)的(de)(de)(de)(de)綜合需求。工(gong)藝的(de)(de)(de)(de)優(you)化常(chang)常(chang)是評(ping)估哪種類型生(sheng)產(chan)zui有效的(de)(de)(de)(de)*途徑。分批是zui常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)以(yi)終點(dian)為依據的(de)(de)(de)(de)生(sheng)產(chan)方(fang)(fang)式(shi)(shi)。在分批生(sheng)產(chan)方(fang)(fang)式(shi)(shi)中(zhong)(zhong)，生(sheng)物(wu)反(fan)應器在接種、培養(yang)(yang)并達到的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞密度(du)和(he)產(chan)品濃度(du)的(de)(de)(de)(de)時即收集細(xi)胞上(shang)清。在補(bu)料(liao)分批工(gong)藝中(zhong)(zhong)，在生(sheng)產(chan)流(liu)程(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)晚期進行補(bu)加(jia)(jia)原(yuan)料(liao)以(yi)改進細(xi)胞活力，增加(jia)(jia)總的(de)(de)(de)(de)產(chan)率。在灌(guan)流(liu)方(fang)(fang)式(shi)(shi)中(zhong)(zhong)，原(yuan)料(liao)溶液持(chi)續加(jia)(jia)入生(sheng)物(wu)反(fan)應器中(zhong)(zhong)，用(yong)過的(de)(de)(de)(de)培養(yang)(yang)基也不斷排出。以(yi)灌(guan)流(liu)方(fang)(fang)式(shi)(shi)來運行工(gong)藝能增加(jia)(jia)培養(yang)(yang)的(de)(de)(de)(de)持(chi)久性和(he)細(xi)胞密度(du)，反(fan)過來又(you)增加(jia)(jia)了(le)整體的(de)(de)(de)(de)生(sheng)產(chan)率3,4,9。我們的目的蛋白，AZ-IL2B，是一個二聚體(ti)融合蛋(dan)白(bai)，由人IL-2 連接人免疫球蛋白特異(yi)針對pIgR 的scFv 區域而組成6。這個融合(he)蛋(dan)白灌流方式的生產。細胞產生的蛋(dan)白水平較低，而(er)且AZ-IL2B 很(hen)脆弱，特別是在(zai)37º C。灌(guan)流生(sheng)(sheng)產所(suo)帶來(lai)的(de)生(sheng)(sheng)產容量(liang)增(zeng)加，以及縮(suo)短了(le)(le)不穩定蛋白(bai)在反應(ying)器(qi)中停留的(de)時間，都有助(zhu)于實(shi)現更高的(de)產量(liang)。本文(wen)總結了(le)(le)Wave Biotech, LLC所(suo)生(sheng)產的一次性生(sheng)物反應器以(yi)灌流方式從25 升(sheng) 工作體(ti)積放大至500升 工作體積的生(sheng)產(chan)放大結果(guo)。我們將比較25 升(sheng)、100 升和500 升 工作(zuo)體積的三個不同系統。對于(yu)每個生物反應(ying)器的運(yun)行都(dou)測定了以
下參數(shu)，包(bao)括：細胞數(shu)量和(he)活力、產生的(de)蛋白數(shu)量、葡萄糖和(he)乳酸水平。對每個(ge)系統(tong)間(jian)的(de)這些參數(shu)進行了(le)比較，結果顯示三(san)個(ge)不(bu)同體積的(de)生物反應器是(shi)相當的(de)。
材(cai)料與方法生物反應(ying)器描述
每個生物反(fan)應器由(you)一個靈活的、一次性的、預先(xian)滅菌(jun)的塑料袋組(zu)成， 這個塑料袋(dai)稱為細胞袋(dai)(Cellbag®)。在操作中(zhong)，細胞袋放置在搖擺平臺上,充入部分培(pei)養基（圖1）。細胞袋的(de)剩(sheng)余(yu)體積則充入了由二氧(yang)化碳（CO2）和氧氣（O2）組成的(de)氣體(ti)混合(he)物。這些氣體(ti)是通過(guo)預留(liu)在細(xi)胞袋上的(de)無菌過(guo)濾入口來添加的(de)。空(kong)氣流(liu)提供(gong)了氧氣，以及控制pH和去(qu)除二(er)氧化碳所(suo)需的(de)氣(qi)(qi)(qi)體交換。廢氣(qi)(qi)(qi)則(ze)通過另一個(ge)無(wu)菌過濾(lv)器和背壓(ya)控(kong)(kong)制閥排出。背壓(ya)控(kong)(kong)制閥確保了細(xi)胞袋(dai)在任何(he)空氣(qi)(qi)(qi)流下(xia)總是充滿(man)(man)的(de)。閥門也防止了細(xi)胞袋(dai)的(de)過度膨脹(zhang)以及爆炸的(de)可能。填充空氣(qi)(qi)(qi)的(de)頂部(bu)空間占據(ju)了細(xi)胞袋(dai)被填滿(man)(man)時的(de)一半(ban)體積.例如，一個(ge)充(chong)滿時是50 升總(zong)體(ti)積(ji)的細胞袋將包含25升 細(xi)胞(bao)懸液和25 升 空氣。空氣在(zai)培養時持續地穿過頂部空間。流程(cheng)中的氣體，如CO2和O2，以(yi)可(ke)控的(de)方式與空氣(qi)混合。液體(ti)(ti)混勻以(yi)及氣(qi)體(ti)(ti)的(de)物質(zhi)傳(chuan)遞是(shi)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)來(lai)回搖(yao)動(dong)(dong)細(xi)胞(bao)袋而實現的(de)。這(zhe)種搖(yao)動(dong)(dong)在氣(qi)相和液相對(dui)(dui)分(fen)界面產(chan)生(sheng)了波動(dong)(dong)。這(zhe)些波動(dong)(dong)大(da)大(da)增加表面積(ji)，能提高氣(qi)體(ti)(ti)轉移。波浪運動(dong)(dong)還(huan)促進(jin)(jin)細(xi)胞(bao)和顆粒(li)離開底部(bu)(bu)懸浮（防(fang)止沉降）以(yi)及大(da)面積(ji)混勻，同時不會(hui)給細(xi)胞(bao)帶來(lai)任(ren)何傷害。搖(yao)動(dong)(dong)可(ke)以(yi)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)設(she)定搖(yao)擺角度和每分(fen)鐘的(de)搖(yao)動(dong)(dong)次數來(lai)控制。這(zhe)些參數必須根(gen)據細(xi)胞(bao)袋中的(de)使用體(ti)(ti)積(ji)來(lai)確(que)定。細(xi)胞(bao)袋的(de)溫(wen)度可(ke)通(tong)(tong)過(guo)(guo)(guo)加熱器來(lai)控制，此(ci)加熱器位于設(she)備的(de)底盤(pan)，對(dui)(dui)細(xi)胞(bao)袋的(de)底部(bu)(bu)進(jin)(jin)行(xing)加熱。加熱器是(shi)由同樣位于單元的(de)底盤(pan)的(de)非插入式的(de)溫(wen)度傳(chuan)感器來(lai)調節(jie)8。另外還設(she)計了特別(bie)的接口，以(yi)供無(wu)菌(jun)加(jia)料(liao)及樣品的取出，而無(wu)需將(jiang)生物反應器置于層流柜中。可用無(wu)菌(jun)的管道連接器將(jiang)培養基、緩沖(chong)液和葡萄糖儲(chu)存液加(jia)入系統中。使用的生物反應器分(fen)別(bie)為(wei)20/50EH 系(xi)統、200 系統和1000 系(xi)統(tong)（WaveBiotech, LLC）。
細胞解凍與增(zeng)殖
我們使(shi)用了P6A2細(xi)胞系(xi)，它是(shi)一(yi)種基于(yu)CHO的懸浮克隆(long)，選擇這個細胞株的原因在于其(qi)蛋白生產(chan)及生長特性俱佳。細胞在120毫升過濾的培(pei)養基中(zhong)解凍，并放置在(zai)150毫升(sheng)的(de)轉(zhuan)瓶內(nei)。細胞在(zai)轉(zhuan)瓶內(nei)擴增，直到有足(zu)夠的(de)細胞來接(jie)種(zhong)更大的(de)轉(zhuan)瓶，一直至6升。一旦培(pei)養物(wu)充(chong)分擴增，即被轉移(yi)到細胞(bao)袋中接種(zhong)。轉瓶內(nei)的(de)細胞(bao)密度維持在約2×105 細胞/毫升。用于擴增的培養基是(shi)帶有添加劑的無血(xue)清的IS CHO-V (IrvineScientific)。我們使用(yong)了血(xue)球(qiu)計數(shu)器來計算細胞(bao)數(shu)量，并利用(yong)臺盼藍染料排除分析來確定細胞(bao)活力。利用(yong)Bioprofile® 300A (Nova Biomedical)來(lai)分析細胞培養(yang)試劑。pH值是(shi)通(tong)過細胞(bao)袋探頭進行在線測定(ding)，或用PHM220 pH計 (Meter Lab)來離(li)線測定。氧(yang)氣、二(er)氧(yang)化(hua)碳、溫度(du)、搖速及搖擺角度(du)是由(you)Wave Bioreactor的(de)控制(zhi)器來測定并控制(zhi)的(de)。
細胞袋(dai)接種(zhong)
細胞一般以1×105-4×105 細胞/毫升的(de)密度接種在細(xi)胞袋生物反應器中(zhong)。我們曾以更低(di)的(de)密度（如(ru)6×104 細胞/毫升）接種細(xi)胞(bao)(bao)，對細(xi)胞(bao)(bao)生長或生產也(ye)沒(mei)有(you)不良影響(xiang)。一旦細(xi)胞(bao)(bao)在轉(zhuan)瓶(ping)中(zhong)充(chong)分擴增(zeng)，就進行細(xi)胞(bao)(bao)袋生物反(fan)應器的(de)接種。這可將轉(zhuan)瓶(ping)的(de)內容(rong)物直(zhi)接轉(zhuan)移(yi)到(dao)生物反(fan)應器內。在此時，生物反(fan)應器已(yi)經充(chong)滿了二氧化碳(tan)和氧氣，并包含溫暖的(de)培養基 (37° C)。細胞(bao)懸浮液由無(wu)菌接(jie)管(guan)連接(jie)到(dao)細胞(bao)袋，然后通(tong)過(guo)無(wu)
菌的端口泵入(ru)生物(wu)反應器中。
生物(wu)反(fan)應器里的增殖
細胞(bao)(bao)袋中的細胞(bao)(bao)能(neng)(neng)達到比轉瓶更高的密度。這zui有可能(neng)(neng)是由于細胞(bao)(bao)袋內(nei)溶氧的增加，以及控(kong)制pH的(de)能力。在轉(zhuan)瓶中， 密度維(wei)持在2×105-6×105 細胞/毫升，加入(ru)細胞袋后， 細胞的密(mi)度(du)增加至(zhi)8×105-1×106 細胞(bao)/毫升，直到在灌(guan)流開始(shi)后(hou)，P6A2細胞克隆(long)的密(mi)度(du)可高達3×107 細胞/毫(hao)升。
灌流
一(yi)旦細胞達(da)到(dao)1×106-2×106 細胞/毫升，即可開始灌流。收集用過的培養基(ji)，同(tong)時以(yi)相同(tong)速率向生物反(fan)應器(qi)中加入(ru)新鮮的培養基(ji)、養分(fen)、調控pH的(de)(de)緩沖液。這是由(you)生物反應(ying)器(qi)的(de)(de)以重量為(wei)基礎的(de)(de)灌流控制器(qi)來直接控制的(de)(de)。在(zai)這個細胞密度下每天的(de)(de)體積交換約為(wei)總體積的(de)(de)70-75%。只要(yao)細胞活力高于50%，反應(ying)器(qi)就持(chi)續灌流。一旦細胞(bao)密(mi)度達到約2×107 細胞/毫升(sheng)，控制乳酸及其他毒副(fu)產物(wu)的累積就變得(de)更加困難，反過(guo)來導致pH的控制也非常困(kun)難。到此階段，要移除部分(fen)細胞從而(er)維持密度在1×107-2×107 細胞/毫升(sheng)。每(mei)天(tian)的體積交換提高至約100%，包括培養基(ji)、緩沖液及(ji)其他添加劑。利用孔徑為0.2μm的中空(kong)纖維微孔過濾柱來灌流細胞培養上清。
通過ELISA和Western Blot進行蛋白分(fen)析
AZ-IL2B目標蛋白的定(ding)量是通(tong)過ELISA進行的。細胞培養上清是以一種于檢測和定量(liang)AZ-IL2B嵌合(he)體(ti)的(de)(de)方(fang)法來分析(xi)的(de)(de)。細胞培(pei)養上清中(zhong)的(de)(de)AZ-IL2B通(tong)過與(yu)包被pIgR區域(yu)特(te)異性(xing)抗體的(de)微滴定板的(de)結合而(er)被捕獲，捕獲的(de)AZ-IL2B通過(guo)生物(wu)素標(biao)記的山羊抗(kang)人(ren)IL-2多克(ke)隆抗體（R&DSystems, Inc.）來檢測。鏈親和素-HRP 結合(he)物（ BD Biosciences,Pharmingen）加入zui后的(de)檢測(ce)步驟(zou)中(zhong)。TMB底物溶液加入反(fan)應中，與
反(fan)應(ying)中存(cun)在的酶直接反(fan)映并(bing)產(chan)生顏(yan)色變(bian)化(hua)(hua)，這種(zhong)顏(yan)色變(bian)化(hua)(hua)與樣品中AZ-IL2B的量(liang)成(cheng)正比(bi)。利用AZ-IL2B標準曲(qu)線和質量對(dui)照來(lai)測定細胞(bao)培養(yang)上清樣品中AZ-IL2B的量。根據標(biao)準(zhun)的步驟(zou)來進行western blot分析7。蛋白通過8-16%的Tris-甘氨酸聚丙烯酰(xian)胺凝膠電(dian)泳(yong)進行大小分(fen)離(li)，并轉移(yi)到硝酸纖維素膜上。膜與一(yi)抗——兔抗人白介素-2 的多克隆抗體（ ChemiconInternational, Inc.）及(ji)二抗——堿性磷酸酶結合的驢抗(kang)兔IgG 抗體
（Pierce Biotechnology, Inc.）一起孵(fu)育。
圖(tu)3. 每(mei)天葡萄糖和(he)乳(ru)酸水平的化學分析。WVA、WVB 和WVC 生物反應器運行的葡萄糖和乳酸水平。
圖4. 每天的蛋白濃(nong)度。三個生(sheng)物(wu)反應(ying)器(qi)運(yun)行的蛋白水平的比較，以毫克(ke)/升表示(shi)。蛋白水(shui)平(ping)通過ELISA 測(ce)定。
結果
生(sheng)物反應器運行WVA、WVB和(he)WVC分別指的是Wave Biotech®的(de)
生物反應器20/50EH系統、200系統和1000系統。
細(xi)胞(bao)計數與活力
圖2顯示了(le)每種生物(wu)(wu)反(fan)應器的細胞生長和密度相當。生物(wu)(wu)反(fan)應器運行WVB沒有達到WVA和WVC那么高的細胞(bao)密(mi)度，但是確實達到了1.2×107 細(xi)胞/毫升。這是由于(yu)在第8天加入了高(gao)濃度(du)的(de)葡萄糖(tang)(tang)后導致的(de)葡萄糖(tang)(tang)峰（圖3）。1.2×10在運行生物反應器WVA后，我們發現(xian)現(xian)有(you)的(de)培養(yang)基配(pei)方(fang)和投料策略無法支持超過(guo)2×107 細胞/毫升(sheng)以上的(de)細胞(bao)密度。在細胞(bao)密度達到3×107 細(xi)胞(bao)/毫升后，WVA的培(pei)養物(wu)(wu)的細胞活力和細胞生長顯(xian)著下降，并(bing)無法恢(hui)復(fu)，這可能是由于缺乏營養物(wu)(wu)，以及毒性物(wu)(wu)質(zhi)的積累(lei)，包括培(pei)養物(wu)(wu)中的高水平(ping)乳酸（圖3）5。氧合不是一個問題(ti)，因(yin)為我們能調節向培養物(wu)中添加(jia)的氧氣(qi)量。每個反(fan)應(ying)器運行(xing)中的溶氧維持在73-100%。2×10
對于隨后(hou)的(de)反應器，在細胞密度達到1.5×107 細胞/毫升(sheng)或更高，乳酸(suan)水平(ping)達2.2 克/升或(huo)更(geng)高(gao)時就(jiu)將(jiang)部分細胞除(chu)去。通過去除(chu)細胞和調整每天的灌流量，生(sheng)物反應(ying)器運行被延長，收(shou)獲(huo)了更(geng)多的蛋白。WVA需要更長時間才到達灌流密度（1.2×106 細(xi)胞/毫升(sheng)），這可能是由于第6天(tian)溫度意外降至(zhi)25° C。WVA灌流持續了(le)13天，平均產量為12.5 毫克/升，而(er)WVB灌流持續了18天，平均為8.3 毫克/升，比WVA多了5天，收(shou)獲蛋白也多了6.7克。WVC灌流(liu)了16天，平均產量為12.2 毫克/升(sheng)，比WVA多了3天，收獲蛋(dan)白也增加了
16.4克。活力的增(zeng)加及生物反應器運行的延長都能使(shi)產量更高(gao)。
蛋白產(chan)量
圖4比(bi)較了每個運行(xing)的蛋白濃度。WVA的蛋白(bai)濃(nong)度(du)（37.5 毫克/升）比(bi)WVB（15.46 毫克/升）或WVC（27.91 毫(hao)克(ke)/升）更高，這是由于更高的細胞(bao)密度。每(mei)個(ge)反(fan)應器的整體蛋白產量如下：WVA 7.8克(ke)，WVB21.4克，WVC 149.2克。蛋白產量(liang)與細胞密(mi)度緊密(mi)關聯。這個解釋是合理(li)的，因(yin)為存在(zai)更多(duo)的細胞，自(zi)然也有更多(duo)的細胞生產蛋白。WVB并沒有達到WVA或WVC那么高的蛋白濃度。這與觀察到的細(xi)胞密度更低是一(yi)致(zhi)的。在圖、5b和5c中，每個反應(ying)器運行的(de)(de)細胞(bao)密(mi)度(du)與蛋(dan)白(bai)(bai)濃度(du)重疊。蛋(dan)白(bai)(bai)濃度(du)的(de)(de)增(zeng)加與細胞(bao)密(mi)度(du)直接相關。在(zai)每個反應(ying)器運行終止時確定細胞(bao)活力(li)的(de)(de)減少(shao)(shao)，以及蛋(dan)白(bai)(bai)產量(liang)的(de)(de)減少(shao)(shao)。
圖5. 蛋白水平與(yu)(yu)活細(xi)胞(bao)密(mi)度。細(xi)胞(bao)密(mi)度與(yu)(yu)蛋白水平的關聯。A. 生物反應(ying)器運行WVA。B. 生物反應器運行(xing)WVB。C. 生物反(fan)應器(qi)運(yun)行WVC。
葡萄(tao)糖(tang)和乳酸濃度
每個運(yun)行中的葡萄糖和(he)乳酸(suan)濃度在(zai)圖3中顯示(shi)。每個運行的水(shui)平基(ji)本(ben)相(xiang)似，除了第9天WVB的葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)峰。由于(yu)每(mei)(mei)個(ge)反應(ying)(ying)器運行持續，細胞(bao)密度不斷(duan)增加，葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)被消耗，而乳酸增加。每(mei)(mei)個(ge)運行后(hou)期(qi)葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)濃度的尖峰是(shi)由于(yu)當生物反應(ying)(ying)器葡(pu)(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)水平降低(di)至2.0 克/升時(shi)，添加了50%的葡萄糖儲存液而(er)引起的。
蛋白分(fen)析
AZ-IL2B 作為一個二聚體蛋(dan)白，跑膠時分子量(liang)在36-50 kDa。圖6(a)是WVD的(de)Western blot，WVD反應器的工作體積為10 升（WaveBiotech 20/50EH系統(tong)）。圖6(b)是WVC的Western blot，它(ta)的(de)工(gong)作體積為(wei)500升。圖中通過Western blot對(dui)第3天到第9天(tian)進行了(le)比(bi)較，顯示小型反應(ying)器與(yu)大型反應(ying)器產生的蛋白之(zhi)間并無區別。
討論
Wave Biotech的一次(ci)性生物反應器(qi)從25升放大到500升，對細胞
生長或蛋白(bai)(bai)生產沒有不(bu)良(liang)影響。其他影響活(huo)力和(he)蛋白(bai)(bai)產量的(de)(de)因素(su)包括高細(xi)胞密(mi)度(du)、不(bu)合適的(de)(de)添加劑濃(nong)度(du)，以及溫度(du)波(bo)動。不(bu)僅(jin)每個系統規格(ge)所產生的(de)(de)蛋白(bai)(bai)水平相似，而且(qie)產生的(de)(de)蛋白(bai)(bai)在Western blot分(fen)析和(he)(he)生(sheng)物活性測試(shi)（數據未顯示）時(shi)也一(yi)致。每(mei)個(ge)系統的(de)(de)細胞(bao)(bao)生(sheng)長和(he)(he)倍增時(shi)間也是相當的(de)(de)。平均的(de)(de)蛋白濃度與(yu)(yu)細胞(bao)(bao)密(mi)度直接(jie)相關。每(mei)個(ge)生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)的(de)(de)葡(pu)萄糖(tang)消(xiao)耗(hao)量與(yu)(yu)乳酸產(chan)量是類似的(de)(de)。隨(sui)著每(mei)個(ge)生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)的(de)(de)運行(xing)，葡(pu)萄糖(tang)水(shui)平下降，而乳酸水(shui)平上升選擇一(yi)次性的(de)(de)生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)實現了生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)運行(xing)之間的(de)(de)快(kuai)速(su)轉換。生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)的(de)(de)安(an)裝、接(jie)種(zhong)以(yi)及處理都很輕松，因(yin)此生(sheng)物反(fan)應(ying)器(qi)運行(xing)的(de)(de)終止以(yi)及新反(fan)應(ying)器(qi)的(de)(de)接(jie)種(zhong)能(neng)在(zai)同一(yi)天(tian)內完成。10升(sheng)、25升和100升生物反(fan)應器能(neng)在標準(zhun)的8小(xiao)時工作日內取下并(bing)重新接(jie)種。500升(sheng)細(xi)胞袋的清空、填充以(yi)及培養(yang)基(ji)預熱需要更長的時間，但生物反應器也能在2個8小(xiao)時工作日內取下并(bing)重新接(jie)種。這(zhe)個過程很簡單：細胞袋(dai)清(qing)空、凈化(hua)并(bing)拋棄。新的預滅菌細胞袋(dai)放置在(zai)平(ping)臺上(shang)，并(bing)充(chong)入二氧(yang)化(hua)碳(tan)和氧(yang)氣。添(tian)加(jia)培養基并(bing)加(jia)熱(re)，接(jie)著進行細胞接(jie)種。10升和(he)25升工作體(ti)(ti)積的生(sheng)物反應器一般(ban)從(cong)轉(zhuan)瓶中接(jie)種。100升和(he)500升的生物反應器則從(cong)小(xiao)型
的25升反應器中接(jie)種。系統從25升到(dao)500升的(de)放大不僅簡單而且成比例，只需對體(ti)積變(bian)
化做出調整。而培養基(ji)配方(fang)或(huo)添加(jia)劑則(ze)無需改變。細胞系在25升、100升和500升反應體系中(zhong)以相似的方式增殖和生(sheng)產(chan)。
圖6. 兩個生物(wu)反應器(qi)運行的(de)Western blot 分析。A. 生物反應器(qi)運行WVD 的工作體(ti)積為10 升。
B. 生物反應(ying)器運行WVC 的工作體(ti)積為500 升。MWM=分子量標準。
結論
成功的(de)(de)灌(guan)(guan)流(liu)(liu)工(gong)藝是在培養(yang)物(wu)健康(kang)與*產(chan)量(liang)之間達到(dao)平衡。適合*的(de)(de)細(xi)胞(bao)生長和對生長有利的(de)(de)因素可能(neng)對生產(chan)不(bu)利。例如，增(zeng)(zeng)加(jia)灌(guan)(guan)流(liu)(liu)速(su)率(lv)以去除(chu)毒(du)性物(wu)質(zhi)會將產(chan)物(wu)稀(xi)(xi)釋到(dao)很低的(de)(de)濃(nong)(nong)度，為下游處理帶來不(bu)便，更不(bu)用(yong)說與灌(guan)(guan)流(liu)(liu)增(zeng)(zeng)加(jia)相關的(de)(de)商(shang)品(pin)費(fei)用(yong)增(zeng)(zeng)加(jia)。對培養(yang)基(ji)成分、添加(jia)劑以及投(tou)料策略的(de)(de)調整(zheng)可能(neng)會增(zeng)(zeng)加(jia)灌(guan)(guan)流(liu)(liu)的(de)(de)天數，而不(bu)稀(xi)(xi)釋蛋白(bai)的(de)(de)濃(nong)(nong)度水平。有報道在生物(wu)反(fan)應器(qi)運(yun)行中采用(yong)兩(liang)種不(bu)同的(de)(de)培養(yang)基(ji)配方來控(kong)制細(xi)胞(bao)代(dai)謝(xie)可降低細(xi)胞(bao)生長，同
時維持其活力，從(cong)而延(yan)長收獲產物的天數1。從生物反應器中去除細(xi)胞也是一(yi)個選擇，我們將它加入工藝中來(lai)控制細(xi)胞密度。這很難頻繁處理(li)，并增加了生物危害的廢料。如果一(yi)
種(zhong)培(pei)養基配方能支持早期(qi)的快速細(xi)胞生長，然(ran)后(hou)在生產(chan)中控制細(xi)胞生長，那是的。
一次性的生物反應器比反復使(shi)用的生物反應器在清洗、滅菌、驗(yan)證(zheng)、安裝和運行之間的轉換時間上(shang)更具優勢。我們證(zheng)明了25升、100升和500升 工作(zuo)體積的系統運行在(zai)細胞生長、蛋白(bai)產(chan)量、葡萄糖消(xiao)耗以(yi)及乳酸生產(chan)上(shang)是相當(dang)的。
文(wen)章來(lai)源：BioProcessing™ 雜(za)志
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